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MONOZUKI’s blog

STAP細胞にかかわる特許請求の範囲を読む

【請求項29】 ~【請求項31】

【請求項29】  細胞が哺乳動物細胞である、請求項1~28のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-28, wherein the cell is a mammalian cell.

【請求項30】  細胞がヒト細胞である、請求項1~29のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-29, wherein the cell is a human cell.

【請求項31】  細胞が成体細胞、新生児細胞、胎児細胞、羊水細胞、または臍帯血細胞である、請求項 1~30のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-30, wherein the cell is an adult cell, a neonatal cell, a fetal cell, amniotic cell, or cord blood cell.


>> 請求項29で初めて新規性にかかわる哺乳動物細胞の限定が記載されるが、 請求項30のヒト細胞に類推適用される根拠はない。

【請求項26】 ~【請求項28】

【請求項26】  多能性細胞を培養して、多能性細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項1~25のいずれか1項記載の方法。

The method of any of claims 1-25, further comprising culturing the pluripotent cell to allow propagation of the pluripotent cell.

【請求項27】  多能性細胞が幹細胞マーカーを発現する、請求項1~26のいずれか1項記載の方法。

The method of any of claims 1-26, wherein the pluripotent cell expresses a stem cell marker.

 

【請求項28】  幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項27記載の方法: Oct4;Nanog;E-カドヘリン、およびSSEA4。

 The method of claim 27, wherein the stem cell marker is selected from the group consisting of:

Oct4; Nanog; E-cadherin, and SSEA4.

>>平成28422(2016.4.22)付手続補正書により、以下の補正が行われている。

【請求項28】  幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項27記載の方法: Oct4;Nanog;E-カドヘリン、およびSSE

 

【請求項23】~【請求項25】

【請求項23】  機械的刺激が、剪断ストレス または/および高圧に細胞を曝露することを含む、請求項13記載の方法。

The method of claim 13, wherein the mechanical stimulus comprises exposing the cell to shear stress or/and high pressure.

【請求項24】  機械的刺激が、細胞のサイズより小さな開口を有する少なくとも1つのデバイスを通して細胞を通過させることを含む、請求項23記載の方法。

The method of claim 23, wherein the mechanical stimulus comprises passing the cell through at least one device with a smaller aperture than the size of the cell.

【請求項25】  機械的刺激が、漸進的により小さな開口を有するいくつかのデバイスを通して細胞を通過させることを含む、請求項23記載の方法。

The method of claim 23, wherein the mechanical stimulus comprises passing the cell through several devices having progressively smaller apertures.

 

>>細胞のトリチュレーションが記載されている。

 

明細書段落【0064】

 多能性細胞の生成を誘導する機械的刺激は、膜の完全性を機械的に破壊する、物質また は表面の細胞膜との任意の形態の接触を含み得る。機械的刺激は、細胞を剪断ストレスお よび/または高圧に曝露することを含み得る。機械的刺激の例示的な形態はトリチュレー ションである。トリチュレーションは、摩擦を介して粒子の表面を研磨および/または摩減するプロセスである。細胞のトリチュレーションのためのプロセスの非限定的な例は、 デバイスを通して細胞を通過させることであり、ここで、デバイスは細胞のサイズより小 さな開口を有する。例えば、真空圧および/または流体の流れによって、ピペットの内部 空間の少なくとも一部が細胞の直径より小さな直径を有するピペットを通して、細胞を通 過させることができる。いくつかの実施態様において、細胞のサイズより小さな開口を有 する少なくとも1つのデバイスを通して細胞を通過させる。いくつかの実施態様において 、漸進的により小さな開口を有するいくつかのデバイスを通して細胞を通過させる。いく つかの実施態様において、5分間以上、例えば、5分間、10分間、20分間、30分間 、または60分間細胞をトリチュレーションすることができる。いくつかの実施態様にお いて、50μmの内径を有するパスツールピペットを通して細胞を通過させることによって、細胞をトリチュレーションすることができる。いくつかの実施態様において、50μ mの内径を有するパスツールピペットを通して20分間細胞を通過させることによって、 細胞をトリチュレーションすることができる。

[0088] Mechanical stimuli that induce the generation of pluripotent cells can include any form of contact of a substance or surface with the cell membrane which will mechanically disrupt the integrity of the membrane. Mechanical stimulus can comprise exposing the cell to shear stress and/or high pressure. An exemplary form of mechanical stimulus is trituration. Trituration is a process of grinding and/or abrading the surface of a particle via friction. A non-limiting example of a process for trituration of a cell is to cause the cell to pass through a device wherein the device has an aperture smaller than the size of the cell. For example, a cell can be caused, by vacuum pressure and/or the flow of a fluid, to pass through a pipette in which at least part of the interior space of the pipette has a diameter smaller than the diameter of the

cell. In some embodiments, the cell is passed through at least one device with a smaller aperture than the size of the cell. In some embodiments, the cell is passed through several devices having progressively smaller apertures. In some embodiments, cells can be triturated for 5 or more minutes, e.g. 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, or 60 minutes. In some embodiments, the cells can be triturated by passing them through a Pasteur pipette with an internal diameter of 50 μm. In some embodiments, the cells can be triturated by passing them through a Pasteur pipette with an internal diameter of 50 μm for 20 minutes.

 

【請求項21】および【請求項22】

【請求項21】  極度な温度への曝露が、35℃未満または42℃超の温度に細胞を曝露することを含む 、請求項13記載の方法。

  The method of claim 13, wherein the exposure to extreme temperatures comprises exposing the cell to temperatures below 35 °C or above 42°C.

【請求項22】  極度な温度への曝露が、凍結以下の温度への細胞の曝露または少なくとも約85℃の温度への細胞の曝露を含む、請求項21記載の方法。

 The method of claim 21, wherein the exposure to extreme temperatures comprises exposing the cell to temperatures at, or below freezing or exposure of the cell to temperatures at least about 85°C

 

 

>>哺乳動物細胞の限定がない段階で、温度範囲を限定しても無意味である。

 

明細書段落【0072】

 多能性細胞の生成を誘導する極度な温度への曝露は、低温または高温のいずれかへの曝 露を含み得る。哺乳動物細胞について、極度な低温は、35℃より低い温度、例えば34 ℃、33℃、32℃、31℃またはより低い温度であり得る。いくつかの実施態様におい て、極度な低温は、凍結より低い温度であり得る。細胞の凍結は、氷結晶による膜穿孔を 引き起こし得、そして細胞質を低下させるための道を提供する。哺乳動物細胞について、 極度な高温は、42℃より高い温度、例えば43℃、44℃、45℃、46℃またはより 高い温度であり得る。いくつかの実施態様において、極度な高温は、約85℃以上の温度 であり得る。極度な温度下での培養の長さは、20分間以上、例えば、20分間、30分 間、1時間、12時間、1日間、2日間、1週間、2週間、3週間、1カ月間、2カ月間 またはより長くであり得る。明らかに、温度が高ければ高いほど、多能性細胞の生成を可能にするために一般に許容される曝露は短くなる。

 

[0096] Exposure to extreme temperatures that induces the generation of pluripotent cells can include exposure to either low temperatures or high temperatures. For a mammalian cell, an extreme low temperature can be a temperature below 35°C, e.g. 34°C, 33°C, 32°C, 31°C, or lower. In some embodiments, an extreme low temperature can be a temperature below freezing. Freezing of cells can cause membrane perforations by ice crystals and provides an avenue for reducing cytoplasm. For a mammalian cell, an extreme high temperature can be a temperature above 42°C, e.g. 43 °C, 44°C, 45°C, 46°C or higher. In some embodiments, the extreme high temperature can be a temperature of about 85°C or higher. The length of culturing under extreme temperatures can be 20 minutes or longer, e.g. 20 minutes, 30 minutes, 1 hour, 12 hours, 1 day, 2 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months or longer. Clearly, the higher the temperature, the shorter the exposure that will generally be tolerated to permit the generation of pluripotent cells.

【請求項17】~【請求項20】

【請求項17】  細胞が2~3日間曝露される、請求項12~16のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 12-16, wherein the cell is exposed for 2-3 days.

【請求項18】  細胞が1日間以下曝露される、請求項12~17のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 12-17, wherein the cell is exposed for 1 day or less.

【請求項19】  細胞が1時間以下曝露される、請求項12~18のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 12-18, wherein the cell is exposed for 1 hour or less.

【請求項20】  細胞が約30分間曝露される、請求項12~19のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 12-19, wherein the cell is exposed for about 30 minutes.

 

>>環境刺激への細胞の曝露は請求項13に記載されており、請求項12ではない。

  曝露時間の限定に関する根拠は不明である。

 

【請求項14】 ~【請求項16】

【請求項14】  ストレスが約3.0~約6.8のpHに細胞を曝露することを含む、請求項1~13のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-13, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 3.0 to about 6.8.

【請求項15】  ストレスが約4.5~約6.0のpHに細胞を曝露することを含む、請求項1~4のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-4, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 4.5 to about 6.0.

【請求項16】  ストレスが約5.4~約5.8のpHに細胞を曝露することを含む、請求項15記載の 方法。

  The method of claim 15, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 5.4 to about 5.8.

 

>>pH5.4~5.6の酸溶液が最も効率的に細胞を変化させるとの記載はあるが、図5Bにおいて上下限値を特定するための閾値に関する記載はない。

 

14a)明細書段落【0155】

 結果

 成熟体細胞に適用された重大な物理的および化学的刺激。胚性転写因子Oct4は細胞 の多能性状態の調節に決定的であると考えられているので、最初のストラテジーは、どの 外部刺激が最も効率的に成熟細胞を変化させて、Oct4を発現するようにリプログラム されるようにするかを同定することであった。未分化細胞の混入を回避するために、まず 、CD45陽性造血系列細胞を研究した。Oct4-GFP(GOF)マウス8から入手 した脾臓から回収したCD45陽性細胞を、種々の重大な物理的および化学的刺激に曝露 した。曝露は以下を含んだ:浸透圧処理、重大な機械的トリチュレーションでの処理、低 pHへの曝露、ストレプトリシンO(SLO)を使用する細胞膜損傷の適用、低栄養への 曝露、ならびに低酸素および高Ca2+濃度への曝露。次に、GFP発現細胞を、FAC Sを使用して同定し、分別し、そして回収した。Oct4の遺伝子発現をRT-PCRに よって確認した。適用した刺激の各々への曝露によって、ある程度成熟細胞がGFPを発 現するようにリプログラミングされた(図5A)。低pHの化学的ストレスおよび重大な 機械的トリチュレーションの物理的ストレスへの成熟細胞の曝露が、成熟細胞をOct4 を発現するように変化させることに最も有効な処理であるようであった。Oct4発現細 胞への転換を誘導するための至適pHを決定するために、CD45陽性細胞を、変動する 酸性(pH4.0~pH6.8)の溶液に曝露した。酸性溶液への曝露の3日後に、細胞 のGFP発現をFACSを使用して分析した。pH5.4~5.6の酸溶液がGFPを発 現するように最も効率的に細胞を変化させた(図5B)。その結果、残りの研究のために 選択するストレス処理として低pHへの曝露に焦点を合わせた。

 

[00180] Results

[00181] Significant physical and chemical stimuli applied to mature somatic cells.

Since the embryonic transcription factor Oct4 is thought to be crucial in regulation of the pluripotent status of cells, the initial strategy was to identify which external stimuli most efficiently altered mature cells to become reprogrammed to express Oct4. CD45 positive hematopoietic lineage cells were first studied in order to avoid contamination with

undifferentiated cells. CD45 positive cells harvested from spleens procured from Oct4-GFP(GOF) mice8 , were exposed to various significant physical and chemical stimuli. The exposures included: osmotic pressure treatment, treatment with significant mechanical trituration, exposure to low pH, application of cell membrane damage using streptolysin O(SLO), exposure to under nutrition and exposure to hypoxia and high Ca2+ concentration. Next, GFP expressing cells were identified, sorted and collected using FACS. Gene expression of Oct4 was confirmed by R-T PCR. Exposure to each of the applied stimuli resulted in reprogramming of the mature cells to express GFP to some degree (Figure 5A). Exposure of the mature cells to the chemical stress of low pH and the physical stress of significant mechanical trituration appeared to be the most effective treatments in altering mature cells to express Oct4. To determine the optimal pH for inducing conversion to Oct4 expressing cells, CD45 positive cells were exposed to solutions of varying acidity, from pH 4.0 to pH 6.8. At 3 days after exposure to an acidic solution, GFP expression of cells was analyzed using FACS. An acid solution with a pH 5.4-5.6 most efficiently altered cells to express GFP (Figure 5B). Consequently, exposure to low pH was focused upon as the stress treatment of choice for the remainder of the study.

 

【請求項13】  

ストレスが以下から選択される少なくとも1つの環境刺激への細胞の曝露を含む、請求 項1~12のいずれか1項記載の方法:外傷、機械的刺激、化学的曝露、超音波刺激、酸素欠乏、照射、極度な温度への曝露、解離、トリチュレーション、物理的ストレス、高浸透圧、低浸透圧、膜損傷、毒素、極度のイオン濃度、活性酸素、UV曝露、強可視光、必須栄養の欠乏、または非生理的酸性環境。

 The method of any of claims 1-12, wherein the stress comprises exposure of the cell to at least one environmental stimulus selected from: trauma, mechanical stimuli, chemical exposure, ultrasonic stimulation, oxygen-deprivation, radiation, exposure to extreme temperatures, dissociation, trituration, physical stress, hyperosmosis, hypoosmosis, membrane damage, toxin, extreme ion concentration, active oxygen, UV exposure, strong visible light, deprivation of essential nutrition, or unphysiolosically acidic environment.

 

>>ストレスの種類が盛り沢山に記載されており、後願排除のためなのか、あるいは実現可能なものが1つくらいあって欲しいという願望なのか。