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MONOZUKI’s blog

STAP細胞にかかわる特許請求の範囲を読む

【請求項46】 および【請求項47】(カテゴリ:アッセイ)

【請求項46】  請求項1~45のいずれか1項記載の方法によって産生される多能性細胞を候補薬剤と接触させることを含む、アッセイ。

An assay comprising;

contacting a pluripotent cell produced by the method according to any of claims 1 to 45 with a candidate agent.

【請求項47】  多能性細胞の生存能、分化、増殖の1つ以上に影響を及ぼす薬剤を同定するための使用のための、請求項46記載のアッセイ。

The assay of claim 46, for use to identify agents which affect one or more of the

viability, differentiation, proliferation of the pluripotent cell.

>> 候補薬剤は以下のとおり。


明細書段落【0091】

本明細書において使用する「候補薬剤」は、細胞、組織または対象に通常は存在しないかまたは投与されるレベルで存在しない任意の物体を指す。候補薬剤を、以下を含む群から選択することができる:化学物質;小有機または無機分子;核酸配列;核酸アナログ;タンパク質;ペプチド;アプタマー;ペプチド模倣物、ペプチド誘導体、ペプチドアナログ、抗体;細胞内抗体;生体高分子、生物材料(例えば、細菌、植物、真菌、または動物細胞もしくは組織)から作製される抽出物;天然のまたは合成の組成物またはその機能的フラグメント。いくつかの実施態様において、候補薬剤は、限定するものではないが、合成のおよび天然の非タンパク質性物体を含む任意の化学的物体または部分である。特定の実施態様において、候補薬剤は化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分は、非置換または置換のアルキル、芳香族、または複素環部分(マクロライド、レプトマイシンおよび関連天然産物もしくはそのアナログを含む)を含む。候補薬剤は、所望の活性および/または性質を有することが知られ得るか、あるいは多様な化合物のライブラリーから選択され得る。

[00115] As used herein, a "candidate agent" refers to any entity which is normally not present or not present at the levels being administered to a cell, tissue or subject. A candidate agent can be selected from a group comprising: chemicals; small organic or inorganic molecules; nucleic acid sequences; nucleic acid analogues; proteins; peptides; aptamers; peptidomimetic, peptide derivative, peptide analogs, antibodies; intrabodies; biological macromolecules, extracts made from biological materials such as bacteria, plants, fungi, or animal cells or tissues; naturally occurring or synthetic compositions or functional fragments thereof. In some embodiments, the candidate agent is any chemical entity or moiety, including without limitation synthetic and naturally-occurring non-proteinaceous entities. In certain embodiments the candidate agent is a small molecule having a chemical moiety. For example, chemical moieties include unsubstituted or substituted alkyl, aromatic, or heterocyclyl moieties including macrolides, leptomycins and related natural products or analogues thereof.

Candidate agents can be known to have a desired activity and/or property, or can be selected from a library of diverse compounds.

 

>>起案日平成29年 2月23日付け拒絶理由通知書で担当審査官は、

 請求項46には「アッセイ」とあり、一般にアッセイとは分析・評価方法を意味するところ、細胞と候補薬剤とを接触させることによって、具体的に何を分析・評価しようとする方法を指すものであるのか、発明の範囲が明確に把握できない。

 と指摘している。

【請求項41】 ~【請求項45】

【請求項41】  ストレスが、ミトコンドリアの少なくとも約40%を細胞から除去すること含む、請求項1~40のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-40, wherein the stress comprises removing at least about 40% of the mitochondria from the cell.

【請求項42】  細胞質の一部の除去が、ミトコンドリアの少なくとも約50%を細胞質から除去する、 請求項41記載の方法。

 The method of claim 41, wherein the removal of a portion of the cytoplasm removes at least about 50% of the mitochondria from the cytoplasm.

【請求項43】  細胞質またはミトコンドリアの除去が、ミトコンドリアの約50%~90%を細胞質か ら除去する、請求項42記載の方法。

 The method of claim 42, wherein the removal of cytoplasm or mitochondria removes about 50%-90% of the mitochondria from the cytoplasm.

【請求項44】  細胞質またはミトコンドリアの除去が、ミトコンドリアの90%超を細胞質から除去す る、請求項42記載の方法。

 The method of claim 42, wherein the removal of cytoplasm or mitochondria removes more than 90% of the mitochondria from the cytoplasm.

【請求項45】  ストレスが、ストレスに曝露された細胞の少なくとも10%の細胞膜を破壊するために十分である、請求項1~44のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-44, wherein the stress is sufficient to disrupt the cellular membrane of at least 10% of cells exposed to the stress.

 

>>細胞へのストレスとして、細胞質またはミトコンドリアの除去、細胞膜の破壊が記載されている。

【請求項35】~【請求項40】

【請求項35】  ストレスが、細胞質の少なくとも約40%を細胞から除去すること含む、請求項1~3 4のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-34, wherein the stress comprises removing at least about 40% of the cytoplasm from the cell.

【請求項36】  細胞質の少なくとも約50%を細胞から除去する、請求項35記載の方法。

 The method of claim 35, wherein at least about 50% of the cytoplasm is removed from the cell.

【請求項37】  細胞質の少なくとも約60%を細胞から除去する、請求項36記載の方法。

 The method of claim 36, wherein at least about 60% of the cytoplasm is removed from the cell.

【請求項38】 細胞質の60~80%を細胞から除去する、請求項37記載の方法。

 

The method of claim 37, wherein between 60-80% of the cytoplasm is removed from the cell.

【請求項39】  細胞質の少なくとも約80%を細胞から除去する、請求項37記載の方法。

The method of claim 37, wherein at least about 80% of the cytoplasm is removed from the cell.

【請求項40】  細胞質の少なくとも約90%を細胞から除去する、請求項39記載の方法。

The method of claim 39, wherein at least about 90% of the cytoplasm is removed from the cell.


>>かなり手荒な方法が記載されている。

 

明細書段落【0059】

 本明細書に記載の多能性細胞(またはより多能性の細胞)を生成する方法は、例えば、 細胞質の一部を細胞から除去することおよび/またはミトコンドリアを細胞から除去する ことを含み得る。いくつかの実施態様において、細胞質またはミトコンドリアの一部の細胞からの除去は、細胞の部分的エピジェネティック制御を除去する。いくつかの実施態様 において、細胞質の少なくとも約40%を除去し、例えば、細胞の細胞質の少なくとも約 40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約 80%、少なくとも約90%、またはより多くを除去する。いくつかの実施態様において 、細胞の細胞質の60%~80%を除去する。いくつかの実施態様において、ミトコンド リアの少なくとも約40%を除去し、例えば、細胞のミトコンドリアの少なくとも約40 %、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80 %、少なくとも約90%、またはより多くを除去する。いくつかの実施態様において、細胞のミトコンドリアの50%~90%を除去する。

[0083] The methods of generating a pluripotent cell (or more pluripotent cell) described herein can comprise, for example, removing part of the cytoplasm from a cell and/or removing mitochondria from a cell. In some embodiments, the removal of part of the cytoplasm or mitochondria from a cell removes partial epigenetic control of the cell. In some embodiments, at least about 40% of the cytoplasm is removed, e.g. at least about 40% , at least about 50% , at least about 60% , at least about 70% , at least about 80% , at least about 90% or more of the cytoplasm of a cell is removed. In some embodiments, between 60% and 80% of the cytoplasm of a cell is removed. In some embodiments, at least about 40% of the mitochondria are removed, e.g. at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90% or more of the mitochondria of a cell are removed. In some embodiments, between 50% and 90% of the mitochondria of a cell are removed.


【請求項32】 ~【請求項34】

【請求項32】  多能性細胞をインビトロで維持する工程をさらに含む、請求項1~31のいずれか1項 記載の方法。

The method of any of claims 1-31, further comprising maintaining the pluripotent cell in vitro.

【請求項33】  細胞のエピジェネティック状態が胚性幹細胞のエピジェネティック状態により近く類似するように変化させられる、請求項1~32のいずれか1項記載の方法。

The method of any of claims 1-32, wherein the epigenetic state of the cell is altered to more closely resemble the epigenetic state of an embryonic stem cell.

【請求項34】  エピジェネティック状態がメチル化パターンを含む、請求項33記載の方法。

The method of claim 33, wherein the epigenetic state comprises methylation patterns.


明細書段落【0012】

 いくつかの実施態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施態様におい て、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は成体細胞または新生児細胞である。いくつかの実施態様において、方法は、多能性細胞をインビトロで維持する 工程をさらに含み得る。いくつかの実施態様において、細胞のエピジェネティック状態は 胚性幹細胞のエピジェネティック状態により近く類似するように変化させられる。いくつ かの実施態様において、エピジェネティック状態はメチル化パターンを含む。

 

[0012] In some embodiments, the cell is a mammalian cell. In some embodiments, the cell is a human cell. In some embodiments, the cell is an adult cell or a neonatal cell. In some embodiments, the method can further comprise maintaining the pluripotent cell in vitro. In some embodiments, the epigenetic state of the cell is altered to more closely resemble the epigenetic state of an embryonic stem cell. In some embodiments, the epigenetic state comprises methylation patterns.

【請求項29】 ~【請求項31】

【請求項29】  細胞が哺乳動物細胞である、請求項1~28のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-28, wherein the cell is a mammalian cell.

【請求項30】  細胞がヒト細胞である、請求項1~29のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-29, wherein the cell is a human cell.

【請求項31】  細胞が成体細胞、新生児細胞、胎児細胞、羊水細胞、または臍帯血細胞である、請求項 1~30のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-30, wherein the cell is an adult cell, a neonatal cell, a fetal cell, amniotic cell, or cord blood cell.


>> 請求項29で初めて新規性にかかわる哺乳動物細胞の限定が記載されるが、 請求項30のヒト細胞に類推適用される根拠はない。

【請求項26】 ~【請求項28】

【請求項26】  多能性細胞を培養して、多能性細胞を増殖させる工程をさらに含む、請求項1~25のいずれか1項記載の方法。

The method of any of claims 1-25, further comprising culturing the pluripotent cell to allow propagation of the pluripotent cell.

【請求項27】  多能性細胞が幹細胞マーカーを発現する、請求項1~26のいずれか1項記載の方法。

The method of any of claims 1-26, wherein the pluripotent cell expresses a stem cell marker.

 

【請求項28】  幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項27記載の方法: Oct4;Nanog;E-カドヘリン、およびSSEA4。

 The method of claim 27, wherein the stem cell marker is selected from the group consisting of:

Oct4; Nanog; E-cadherin, and SSEA4.

>>平成28422(2016.4.22)付手続補正書により、以下の補正が行われている。

【請求項28】  幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項27記載の方法: Oct4;Nanog;E-カドヘリン、およびSSE

 

【請求項23】~【請求項25】

【請求項23】  機械的刺激が、剪断ストレス または/および高圧に細胞を曝露することを含む、請求項13記載の方法。

The method of claim 13, wherein the mechanical stimulus comprises exposing the cell to shear stress or/and high pressure.

【請求項24】  機械的刺激が、細胞のサイズより小さな開口を有する少なくとも1つのデバイスを通して細胞を通過させることを含む、請求項23記載の方法。

The method of claim 23, wherein the mechanical stimulus comprises passing the cell through at least one device with a smaller aperture than the size of the cell.

【請求項25】  機械的刺激が、漸進的により小さな開口を有するいくつかのデバイスを通して細胞を通過させることを含む、請求項23記載の方法。

The method of claim 23, wherein the mechanical stimulus comprises passing the cell through several devices having progressively smaller apertures.

 

>>細胞のトリチュレーションが記載されている。

 

明細書段落【0064】

 多能性細胞の生成を誘導する機械的刺激は、膜の完全性を機械的に破壊する、物質また は表面の細胞膜との任意の形態の接触を含み得る。機械的刺激は、細胞を剪断ストレスお よび/または高圧に曝露することを含み得る。機械的刺激の例示的な形態はトリチュレー ションである。トリチュレーションは、摩擦を介して粒子の表面を研磨および/または摩減するプロセスである。細胞のトリチュレーションのためのプロセスの非限定的な例は、 デバイスを通して細胞を通過させることであり、ここで、デバイスは細胞のサイズより小 さな開口を有する。例えば、真空圧および/または流体の流れによって、ピペットの内部 空間の少なくとも一部が細胞の直径より小さな直径を有するピペットを通して、細胞を通 過させることができる。いくつかの実施態様において、細胞のサイズより小さな開口を有 する少なくとも1つのデバイスを通して細胞を通過させる。いくつかの実施態様において 、漸進的により小さな開口を有するいくつかのデバイスを通して細胞を通過させる。いく つかの実施態様において、5分間以上、例えば、5分間、10分間、20分間、30分間 、または60分間細胞をトリチュレーションすることができる。いくつかの実施態様にお いて、50μmの内径を有するパスツールピペットを通して細胞を通過させることによって、細胞をトリチュレーションすることができる。いくつかの実施態様において、50μ mの内径を有するパスツールピペットを通して20分間細胞を通過させることによって、 細胞をトリチュレーションすることができる。

[0088] Mechanical stimuli that induce the generation of pluripotent cells can include any form of contact of a substance or surface with the cell membrane which will mechanically disrupt the integrity of the membrane. Mechanical stimulus can comprise exposing the cell to shear stress and/or high pressure. An exemplary form of mechanical stimulus is trituration. Trituration is a process of grinding and/or abrading the surface of a particle via friction. A non-limiting example of a process for trituration of a cell is to cause the cell to pass through a device wherein the device has an aperture smaller than the size of the cell. For example, a cell can be caused, by vacuum pressure and/or the flow of a fluid, to pass through a pipette in which at least part of the interior space of the pipette has a diameter smaller than the diameter of the

cell. In some embodiments, the cell is passed through at least one device with a smaller aperture than the size of the cell. In some embodiments, the cell is passed through several devices having progressively smaller apertures. In some embodiments, cells can be triturated for 5 or more minutes, e.g. 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, or 60 minutes. In some embodiments, the cells can be triturated by passing them through a Pasteur pipette with an internal diameter of 50 μm. In some embodiments, the cells can be triturated by passing them through a Pasteur pipette with an internal diameter of 50 μm for 20 minutes.