【請求項１２】

ストレスが組織または細胞培養物における非生理的ストレスを含む、請求項１～１１の いずれか１項記載の方法。

The method of any of claims 1-11, wherein the stress comprises unphysiological stress in tissue or cell culture.

＞＞ここで、初めてストレスについて言及する記載がある。

　明細書段落【００６０】

　細胞をストレスに供しそして／または細胞質もしくはミトコンドリアの一部を細胞から 除去する方法は、致死性の閾値より下で細胞の膜において細孔および／または破裂を引き 起こす任意の環境刺激であり得る。ストレスは、組織または細胞培養物における非生理的 ストレスを含み得る。適切な環境刺激の非限定的な例は、外傷、機械的刺激、化学的曝露 、超音波刺激、酸素欠乏、栄養欠乏、照射、極度な温度への曝露、解離、トリチュレーシ ョン（trituration）、物理的ストレス、高浸透圧、低浸透圧、膜損傷、毒素、極度のイ オン濃度、活性酸素、ＵＶ曝露、強可視光、必須栄養の欠乏、または非生理的酸性環境を 含む。いくつかの実施態様において、１つの環境刺激が細胞に適用され得る。いくつかの 実施態様において、複数の環境刺激が細胞に適用され得、例えば、２つの刺激、３つの刺 激、４つの刺激、またはより多くの刺激が適用され得る。複数の環境刺激を同時にまたは 別々に適用し得る。

　[0084] The method of subjecting the cell to stress and/or removing part of the cytoplasm or mitochondria from a cell can be any environmental stimulus that will cause pores and/or ruptures in the membrane of a cell below the threshold of lethality. The stress may comprise unphysiological stress in tissue or cell culture. Non-limiting examples of suitable environmental stimuli include trauma, mechanical stimuli, chemical exposure, ultrasonic stimulation, oxygen-deprivation, nutrient-deprivation, radiation, exposure to extreme temperatures, dissociation, trituration, physical stress, hyper osmosis, hypo osmosis, membrane damage, toxin, extreme ion concentration, active oxygen, UV exposure, strong visible light, deprivation of essential nutrition, or unphysiologically acidic environment. In some embodiments, one environmental stimulus can be applied to a cell. In some embodiments, multiple environmental stimuli can be applied to a cell, e.g. 2 stimuli, 3 stimuli, 4 stimuli or more stimuli can be applied. Multiple environmental stimuli can be applied concurrently or separately.

【請求項１１】

多能性を示す細胞を選択する工程が、接着性でない細胞を選択することを含む、請求項 １～１０のいずれか１項記載の方法。

　The method of any of claims 1-10, wherein selecting the cell exhibiting pluripotency comprises selecting a cell which is not adherent.

＞＞明細書には「接着性」に関する具体的な記載がない。

明細書段落 【０００６】

　１つの局面において、本明細書に、細胞をストレスに供する工程を含む、多能性細胞を 生成する方法を記載する。いくつかの実施態様において、方法は、多能性を示す細胞を選 択する工程をさらに含み得る。いくつかの実施態様において、細胞は組織の部分として存 在しない。いくつかの実施態様において、ストレスは、細胞質の少なくとも約４０％を細 胞から除去すること含む。いくつかの実施態様において、ストレスは、ミトコンドリアの 少なくとも約４０％を細胞から除去すること含む。いくつかの実施態様において、ストレ スは、ストレスに曝露された細胞の少なくとも１０％の細胞膜を破壊するために十分であ る。いくつかの実施態様において、細胞は体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞である 。いくつかの実施態様において、細胞は単離された細胞である。いくつかの実施態様にお いて、細胞は細胞の不均一な集団中に存在する。いくつかの実施態様において、細胞は細 胞の均一な集団中に存在する。いくつかの実施態様において、多能性を示す細胞を選択す る工程は、Ｏｃｔ４もしくはＮａｎｏｇ、またはＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ発現を発現す る細胞を選択することを含む。いくつかの実施態様において、多能性を示す細胞を選択す る工程は、接着性でない細胞を選択することを含む。

[0006] In one aspect, described herein is a method to generate a pluripotent cell, comprising subjecting a cell to a stress. In some embodiments, the method can further comprise selecting cells exhibiting pluripotency. In some embodiments, the cell is not present as part of a tissue. In some embodiments, the stress comprises removing at least about 40% of the cytoplasm from the cell. In some embodiments, the stress comprises removing at least about 40% of the mitochondria from the cell. In some embodiments, the stress is sufficient to disrupt the cellular membrane of at least 10% of cells exposed to the stress. In some embodiments, the cell is a somatic cell, a stem cell, a progenitor cell or an embryonic cell. In some embodiments, the cell is an isolated cell. In some embodiments, the cell is present in a heterogeneous population of cells. In some embodiments, the cell is present in a homogenous population of cells. In some embodiments, selecting the cells exhibiting pluripotency comprises selecting cells expressing Oct4 or Nanog, or Oct4 and Nanog expression. In some embodiments, selecting cells exhibiting pluripotency comprises selecting cell which are not adherent.

【請求項１０】

幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項９記載の方法： Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリン、およびＳＳＥＡ４。

The method of any of claim 9, wherein the stem cell marker is selected from the group consisting of :Oct4; Nanog; E-cadherin, and SSEA4.

＞＞平成28年4月22日(2016.4.22)付手続補正書により、以下の補正が行われている。

【請求項１０】 　幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項９記載の方法： Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリン、およびＳＳＥＡ。

【請求項９】

多能性を示す細胞を選択する工程が、幹細胞マーカーを発現する細胞を選択することを 含む、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。

The method of any of claims 1-8, wherein selecting the cell exhibiting pluripotency comprises selecting a cell expressing a stem cell marker.

＞＞細胞の選択工程の記載は請求項３にあり、そのひとつが幹細胞マーカーによる方法である。

明細書段落【０１４１】 　いくつかの実施態様において、培養工程の後に、細胞は検出可能なそして／または増加 したレベルの幹細胞マーカーを発現し得る。幹細胞マーカーおよびそれを検出する方法は 本明細書において他所に記載されている。いくつかの実施態様において、幹細胞マーカー は、以下からなる群より選択され得る：Ｏｃｔ３／４；Ｎａｎｏｇ；Ｒｅｘ１；Ｋｌｆ４ ；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ２；Ｅｓｒｒ－β；Ｔｂｘ３；およびＫｌｆ５。

[00165] In some embodiments, after the culturing step, the cell can express a detectable and/or increased level of a stem cell marker. Stem cell markers and methods of detecting them are described elsewhere herein. In some embodiments, the stem cell marker can be selected from the group consisting of Oct3/4; Nanog; Rex1; Klf4; Sox2; Klf2; Esrr-beta; Tbx3; and Klf5.

【請求項８】

 細胞が細胞の均一な集団中に存在する、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。

The method of any of claims 1-7, wherein the cell is present in a homogenous population of cells.

＞＞請求項７の引用は矛盾である（請求項６の誤記と思われる）。

【請求項７】

細胞が細胞の不均一な集団中に存在する、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。

The method of any of claims 1-6, wherein the cell is present in a heterogeneous population of cells.

＞＞ たった２個の細胞でも「細胞の集団」なのか？？

　　　多くの細胞の群から多能性細胞を見つけ出すのは至難の業である。

7a） 明細書段落 【００５７】

　いくつかの実施態様において、細胞は、組織中には存在しないが、細胞の集団中に存在 する。いくつかの実施態様において、細胞の集団は細胞の集団である。本明細書において 使用する「細胞の集団」は、少なくとも２個の細胞、例えば、２個の細胞、３個の細胞、 ４個の細胞、１０個の細胞、１００個の細胞、１０００個の細胞、１０，０００個の細胞 、１００，０００細胞、または任意の間の数、またはより多くの細胞の群を指す。任意に 、細胞の集団は、共通の起源を有する細胞であり得、例えば、それは同じ親細胞の子孫で あり得るか、それはクローン性であり得るか、それは同じ組織から単離された細胞から単 離されたかもしくはその子孫であり得るか、またはそれは同じ組織サンプルから単離され た細胞から単離されたかもしくはその子孫であり得る。細胞の集団は、１つ以上の細胞型 、例えば、１つの細胞型、２つの細胞型、３つの細胞型、４つの細胞型、またはより多く の細胞型を含み得る。細胞の集団は、不均一または均一であり得る。細胞の集団は、それ が少なくとも９０％の同じ細胞型を含む（例えば、集団中の細胞の９０％、９２％、９５％、９８％、９９％、またはより多くが同じ細胞型のものである）場合、実質的に均一で あり得る。細胞の集団は、集団中に存在する細胞の９０％未満が同じ細胞型のものである 場合、不均一であり得る。

[0081] In some embodiments, a cell, while not present in a tissue, is present in a population of cells. In some embodiments, the population of cells is a population of cells. As used herein, a "population of cells" refers to a group of at least 2 cells, e.g. 2 cells, 3 cells, 4 cells, 10 cells, 100 cells, 1000 cells, 10,000 cells, 100,000 cells or any value in between, or more cells. Optionally, a population of cells can be cells which have a common origin, e.g. they can be descended from the same parental cell, they can be clonal, they can be isolated from or descended from cells isolated from the same tissue, or they can be isolated from or descended from cells isolated from the same tissue sample. A population of cells can comprise 1 or more cell types, e.g. 1 cell type, 2 cell types, 3 cell types, 4 cell types or more cell types. A population of cells can be heterogeneous or homogeneous. A population of cells can be substantially homogeneous if it comprises at least 90% of the same cell type, e.g. 90%, 92%, 95% , 98% , 99%o, or more of the cells in the population are of the same cell type. A population of cells can be heterogeneous if less than 90% of the cells present in the population are of the same cell type.

【請求項６】

　細胞が単離された細胞である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。

　The method of any of claims 1-5, wherein the cell is an isolated cell.

＞＞細胞を単離するための方法が周知であるとの記載がある。

6a） 明細書段落【００５６】

　本明細書に記載の方法において使用する細胞は、組織中に存在しない細胞であり得る。 本明細書において使用する「組織」は、少なくとも１つの特定の機能の実行において結び 付けられた、同様に専門化された細胞の組織化された生物材料（例えば、群、層、または 凝集体）を指す。細胞が組織化された超構造から取り出されるか、またはそうでなければ インビボで存在する組織化された超構造から分離されると、それはもはや組織中に存在し ない。例えば、血液サンプルが２つ以上の非同一画分に分離されるか、または脾臓が刻ま れそしてパスツールピペットを用いて機械的に解離されると、細胞はもはや組織中に存在 しない。いくつかの実施態様において、組織中に存在しない細胞は、単離された細胞であ る。細胞に関して本明細書において使用する用語「単離」は、インビボでそれが通常結合 している別の細胞群から機械的または物理的に分離されている細胞を指す。別の細胞群か ら１つ以上の細胞を単離するための方法は当該分野において周知である。例えば、Cultur e of Animal Cells: a manual of basic techniques (3rd edition), 1994, R. I. Freshney (ed.), Wiley-Liss, Inc.；Cells: a laboratory manual (vol. 1), 1998, D. L. Sp ector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J. Morgan, John Wiley and Sons, Ltd.を参照のこと。任意に、単離された細胞は、例えば他の細胞の存在下で 、インビトロで培養されている。

[0080] The cell used in the methods described herein can be a cell which is not present in a tissue. As used herein, a "tissue" refers to an organized biomaterial (e.g. a group, layer, or aggregation) of similarly specialized cells united in the performance of at least one particular function. When cells are removed from an organized superstructure, or otherwise separated from an organized superstructure which exists in vivo, they are no longer present in a tissue. For example, when a blood sample is separated into two or more non-identical fractions, or a spleen is minced and mechanically-dissociated with Pasteur pipettes, the cells are no longer present in a tissue. In some embodiments, cells which are not present in a tissue are isolated cells. The term "isolated" as used herein in reference to cells refers to a cell that is mechanically or physically separated from another group of cells with which they are normally associated in vivo. Methods for isolating one or more cells from another group of cells are well known in the art. See, e.g., Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3rd edition), 1994, R. I. Freshney (ed.), Wiley-Liss, Inc.; Cells: a laboratory manual (vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J. Morgan, John Wiley and Sons, Ltd. Optionally the isolated cell has been cultured in vitro, e.g., in the presence of other cells.