【請求項２１】および【請求項２２】
【請求項２１】 極度な温度への曝露が、３５℃未満または４２℃超の温度に細胞を曝露することを含む 、請求項１３記載の方法。
The method of claim 13, wherein the exposure to extreme temperatures comprises exposing the cell to temperatures below 35 °C or above 42°C.
【請求項２２】 極度な温度への曝露が、凍結以下の温度への細胞の曝露または少なくとも約８５℃の温度への細胞の曝露を含む、請求項２１記載の方法。
The method of claim 21, wherein the exposure to extreme temperatures comprises exposing the cell to temperatures at, or below freezing or exposure of the cell to temperatures at least about 85°C
＞＞哺乳動物細胞の限定がない段階で、温度範囲を限定しても無意味である。
明細書段落【００７２】
多能性細胞の生成を誘導する極度な温度への曝露は、低温または高温のいずれかへの曝 露を含み得る。哺乳動物細胞について、極度な低温は、３５℃より低い温度、例えば３４ ℃、３３℃、３２℃、３１℃またはより低い温度であり得る。いくつかの実施態様におい て、極度な低温は、凍結より低い温度であり得る。細胞の凍結は、氷結晶による膜穿孔を 引き起こし得、そして細胞質を低下させるための道を提供する。哺乳動物細胞について、 極度な高温は、４２℃より高い温度、例えば４３℃、４４℃、４５℃、４６℃またはより 高い温度であり得る。いくつかの実施態様において、極度な高温は、約８５℃以上の温度 であり得る。極度な温度下での培養の長さは、２０分間以上、例えば、２０分間、３０分 間、１時間、１２時間、１日間、２日間、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間 またはより長くであり得る。明らかに、温度が高ければ高いほど、多能性細胞の生成を可能にするために一般に許容される曝露は短くなる。
[0096] Exposure to extreme temperatures that induces the generation of pluripotent cells can include exposure to either low temperatures or high temperatures. For a mammalian cell, an extreme low temperature can be a temperature below 35°C, e.g. 34°C, 33°C, 32°C, 31°C, or lower. In some embodiments, an extreme low temperature can be a temperature below freezing. Freezing of cells can cause membrane perforations by ice crystals and provides an avenue for reducing cytoplasm. For a mammalian cell, an extreme high temperature can be a temperature above 42°C, e.g. 43 °C, 44°C, 45°C, 46°C or higher. In some embodiments, the extreme high temperature can be a temperature of about 85°C or higher. The length of culturing under extreme temperatures can be 20 minutes or longer, e.g. 20 minutes, 30 minutes, 1 hour, 12 hours, 1 day, 2 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months or longer. Clearly, the higher the temperature, the shorter the exposure that will generally be tolerated to permit the generation of pluripotent cells.
【請求項１７】～【請求項２０】
【請求項１７】 細胞が２～３日間曝露される、請求項１２～１６のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 12-16, wherein the cell is exposed for 2-3 days.
【請求項１８】 細胞が１日間以下曝露される、請求項１２～１７のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 12-17, wherein the cell is exposed for 1 day or less.
【請求項１９】 細胞が１時間以下曝露される、請求項１２～１８のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 12-18, wherein the cell is exposed for 1 hour or less.
【請求項２０】 細胞が約３０分間曝露される、請求項１２～１９のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 12-19, wherein the cell is exposed for about 30 minutes.
＞＞環境刺激への細胞の曝露は請求項１３に記載されており、請求項１２ではない。
曝露時間の限定に関する根拠は不明である。
＞＞平成２９年９月７日付け手続補正書にて追加された請求項
【請求項２０】 細胞を、ｐＨ５．４～５．８の低ｐＨストレスに供する工程を含む、該細胞においてＯｃｔ４遺伝子の発現を誘導する方法であって、ここで、ｐＨの調整が、ＡＴＰを用いて行われることを特徴とする、方法。
【請求項２１】 細胞を、ｐＨ５．４～５．８の低ｐＨストレスに供する工程を含む、Ｏｃｔ４遺伝子を発現する細胞の製造方法であって、ここで、ｐＨの調整が、ＡＴＰを用いて行われることを特徴とする、方法。
【請求項１４】 ～【請求項１６】
【請求項１４】 ストレスが約３．０～約６．８のｐＨに細胞を曝露することを含む、請求項１～１３のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 1-13, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 3.0 to about 6.8.
【請求項１５】 ストレスが約４．５～約６．０のｐＨに細胞を曝露することを含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 1-4, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 4.5 to about 6.0.
【請求項１６】 ストレスが約５．４～約５．８のｐＨに細胞を曝露することを含む、請求項１５記載の 方法。
The method of claim 15, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 5.4 to about 5.8.
＞＞ｐＨ５．４～５．６の酸溶液が最も効率的に細胞を変化させるとの記載はあるが、図５Ｂにおいて上下限値を特定するための閾値に関する記載はない。
＞＞平成２９年９月７日付け手続補正書で削除された。補正後の請求項１には、「５．４～５．８のｐＨ」と記載されている。
１４a）明細書段落【０１５５】
結果
成熟体細胞に適用された重大な物理的および化学的刺激。胚性転写因子Ｏｃｔ4は細胞 の多能性状態の調節に決定的であると考えられているので、最初のストラテジーは、どの 外部刺激が最も効率的に成熟細胞を変化させて、Ｏｃｔ４を発現するようにリプログラム されるようにするかを同定することであった。未分化細胞の混入を回避するために、まず 、ＣＤ４５陽性造血系列細胞を研究した。Ｏｃｔ４－ＧＦＰ（ＧＯＦ）マウス８から入手 した脾臓から回収したＣＤ４５陽性細胞を、種々の重大な物理的および化学的刺激に曝露 した。曝露は以下を含んだ：浸透圧処理、重大な機械的トリチュレーションでの処理、低 ｐＨへの曝露、ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）を使用する細胞膜損傷の適用、低栄養への 曝露、ならびに低酸素および高Ｃａ２＋濃度への曝露。次に、ＧＦＰ発現細胞を、ＦＡＣ Ｓを使用して同定し、分別し、そして回収した。Ｏｃｔ４の遺伝子発現をＲＴ－ＰＣＲに よって確認した。適用した刺激の各々への曝露によって、ある程度成熟細胞がＧＦＰを発 現するようにリプログラミングされた（図５Ａ）。低ｐＨの化学的ストレスおよび重大な 機械的トリチュレーションの物理的ストレスへの成熟細胞の曝露が、成熟細胞をＯｃｔ４ を発現するように変化させることに最も有効な処理であるようであった。Ｏｃｔ４発現細 胞への転換を誘導するための至適ｐＨを決定するために、ＣＤ４５陽性細胞を、変動する 酸性（ｐＨ４．０～ｐＨ６．８）の溶液に曝露した。酸性溶液への曝露の３日後に、細胞 のＧＦＰ発現をＦＡＣＳを使用して分析した。ｐＨ５．４～５．６の酸溶液がＧＦＰを発 現するように最も効率的に細胞を変化させた（図５Ｂ）。その結果、残りの研究のために 選択するストレス処理として低ｐＨへの曝露に焦点を合わせた。
[00180] Results
[00181] Significant physical and chemical stimuli applied to mature somatic cells.
Since the embryonic transcription factor Oct4 is thought to be crucial in regulation of the pluripotent status of cells, the initial strategy was to identify which external stimuli most efficiently altered mature cells to become reprogrammed to express Oct4. CD45 positive hematopoietic lineage cells were first studied in order to avoid contamination with
undifferentiated cells. CD45 positive cells harvested from spleens procured from Oct4-GFP(GOF) mice8 , were exposed to various significant physical and chemical stimuli. The exposures included: osmotic pressure treatment, treatment with significant mechanical trituration, exposure to low pH, application of cell membrane damage using streptolysin O(SLO), exposure to under nutrition and exposure to hypoxia and high Ca2+ concentration. Next, GFP expressing cells were identified, sorted and collected using FACS. Gene expression of Oct4 was confirmed by R-T PCR. Exposure to each of the applied stimuli resulted in reprogramming of the mature cells to express GFP to some degree (Figure 5A). Exposure of the mature cells to the chemical stress of low pH and the physical stress of significant mechanical trituration appeared to be the most effective treatments in altering mature cells to express Oct4. To determine the optimal pH for inducing conversion to Oct4 expressing cells, CD45 positive cells were exposed to solutions of varying acidity, from pH 4.0 to pH 6.8. At 3 days after exposure to an acidic solution, GFP expression of cells was analyzed using FACS. An acid solution with a pH 5.4-5.6 most efficiently altered cells to express GFP (Figure 5B). Consequently, exposure to low pH was focused upon as the stress treatment of choice for the remainder of the study.
【請求項１３】
ストレスが以下から選択される少なくとも１つの環境刺激への細胞の曝露を含む、請求 項１～１２のいずれか１項記載の方法：外傷、機械的刺激、化学的曝露、超音波刺激、酸素欠乏、照射、極度な温度への曝露、解離、トリチュレーション、物理的ストレス、高浸透圧、低浸透圧、膜損傷、毒素、極度のイオン濃度、活性酸素、ＵＶ曝露、強可視光、必須栄養の欠乏、または非生理的酸性環境。
The method of any of claims 1-12, wherein the stress comprises exposure of the cell to at least one environmental stimulus selected from: trauma, mechanical stimuli, chemical exposure, ultrasonic stimulation, oxygen-deprivation, radiation, exposure to extreme temperatures, dissociation, trituration, physical stress, hyperosmosis, hypoosmosis, membrane damage, toxin, extreme ion concentration, active oxygen, UV exposure, strong visible light, deprivation of essential nutrition, or unphysiolosically acidic environment.
＞＞ストレスの種類が盛り沢山に記載されており、後願排除のためなのか、あるいは実現可能なものが１つくらいあって欲しいという願望なのか。
【請求項１２】
ストレスが組織または細胞培養物における非生理的ストレスを含む、請求項１～１１の いずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 1-11, wherein the stress comprises unphysiological stress in tissue or cell culture.
＞＞ここで、初めてストレスについて言及する記載がある。
明細書段落【００６０】
細胞をストレスに供しそして／または細胞質もしくはミトコンドリアの一部を細胞から 除去する方法は、致死性の閾値より下で細胞の膜において細孔および／または破裂を引き 起こす任意の環境刺激であり得る。ストレスは、組織または細胞培養物における非生理的 ストレスを含み得る。適切な環境刺激の非限定的な例は、外傷、機械的刺激、化学的曝露 、超音波刺激、酸素欠乏、栄養欠乏、照射、極度な温度への曝露、解離、トリチュレーシ ョン（trituration）、物理的ストレス、高浸透圧、低浸透圧、膜損傷、毒素、極度のイ オン濃度、活性酸素、ＵＶ曝露、強可視光、必須栄養の欠乏、または非生理的酸性環境を 含む。いくつかの実施態様において、１つの環境刺激が細胞に適用され得る。いくつかの 実施態様において、複数の環境刺激が細胞に適用され得、例えば、２つの刺激、３つの刺 激、４つの刺激、またはより多くの刺激が適用され得る。複数の環境刺激を同時にまたは 別々に適用し得る。
[0084] The method of subjecting the cell to stress and/or removing part of the cytoplasm or mitochondria from a cell can be any environmental stimulus that will cause pores and/or ruptures in the membrane of a cell below the threshold of lethality. The stress may comprise unphysiological stress in tissue or cell culture. Non-limiting examples of suitable environmental stimuli include trauma, mechanical stimuli, chemical exposure, ultrasonic stimulation, oxygen-deprivation, nutrient-deprivation, radiation, exposure to extreme temperatures, dissociation, trituration, physical stress, hyper osmosis, hypo osmosis, membrane damage, toxin, extreme ion concentration, active oxygen, UV exposure, strong visible light, deprivation of essential nutrition, or unphysiologically acidic environment. In some embodiments, one environmental stimulus can be applied to a cell. In some embodiments, multiple environmental stimuli can be applied to a cell, e.g. 2 stimuli, 3 stimuli, 4 stimuli or more stimuli can be applied. Multiple environmental stimuli can be applied concurrently or separately.
【請求項１１】
多能性を示す細胞を選択する工程が、接着性でない細胞を選択することを含む、請求項 １～１０のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 1-10, wherein selecting the cell exhibiting pluripotency comprises selecting a cell which is not adherent.
＞＞明細書には「接着性」に関する具体的な記載がない。
明細書段落 【０００６】
１つの局面において、本明細書に、細胞をストレスに供する工程を含む、多能性細胞を 生成する方法を記載する。いくつかの実施態様において、方法は、多能性を示す細胞を選 択する工程をさらに含み得る。いくつかの実施態様において、細胞は組織の部分として存 在しない。いくつかの実施態様において、ストレスは、細胞質の少なくとも約４０％を細 胞から除去すること含む。いくつかの実施態様において、ストレスは、ミトコンドリアの 少なくとも約４０％を細胞から除去すること含む。いくつかの実施態様において、ストレ スは、ストレスに曝露された細胞の少なくとも１０％の細胞膜を破壊するために十分であ る。いくつかの実施態様において、細胞は体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞である 。いくつかの実施態様において、細胞は単離された細胞である。いくつかの実施態様にお いて、細胞は細胞の不均一な集団中に存在する。いくつかの実施態様において、細胞は細 胞の均一な集団中に存在する。いくつかの実施態様において、多能性を示す細胞を選択す る工程は、Ｏｃｔ４もしくはＮａｎｏｇ、またはＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ発現を発現す る細胞を選択することを含む。いくつかの実施態様において、多能性を示す細胞を選択す る工程は、接着性でない細胞を選択することを含む。
[0006] In one aspect, described herein is a method to generate a pluripotent cell, comprising subjecting a cell to a stress. In some embodiments, the method can further comprise selecting cells exhibiting pluripotency. In some embodiments, the cell is not present as part of a tissue. In some embodiments, the stress comprises removing at least about 40% of the cytoplasm from the cell. In some embodiments, the stress comprises removing at least about 40% of the mitochondria from the cell. In some embodiments, the stress is sufficient to disrupt the cellular membrane of at least 10% of cells exposed to the stress. In some embodiments, the cell is a somatic cell, a stem cell, a progenitor cell or an embryonic cell. In some embodiments, the cell is an isolated cell. In some embodiments, the cell is present in a heterogeneous population of cells. In some embodiments, the cell is present in a homogenous population of cells. In some embodiments, selecting the cells exhibiting pluripotency comprises selecting cells expressing Oct4 or Nanog, or Oct4 and Nanog expression. In some embodiments, selecting cells exhibiting pluripotency comprises selecting cell which are not adherent.
【請求項１０】
幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項９記載の方法： Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリン、およびＳＳＥＡ４。
The method of any of claim 9, wherein the stem cell marker is selected from the group consisting of :Oct4; Nanog; E-cadherin, and SSEA4.
＞＞平成28年4月22日(2016.4.22)付手続補正書により、以下の補正が行われている。
【請求項１０】 幹細胞マーカーが以下からなる群より選択される、請求項９記載の方法： Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリン、およびＳＳＥＡ。
