【請求項１】 （カテゴリ：方法）
細胞をストレスに供する工程を含む、多能性細胞を生成する方法。
A method to generate a pluripotent cell, comprising subjecting a cell to a stress.
＞＞生物細胞をストレスに晒すだけで多能性細胞を生成できることに、いままで科学者が気づかなかったとは考えにくい。
1ａ）明細書段落【０１４７】
実施例１
全ての生物は原始的な生存本能を保有している。植物が重大な外的ストレスに供される と、それらは、細胞の脱分化を引き起こしそして損傷領域または生物全体の再生を可能にする、生存するための機構を活性化させる。そのような機構は下等生物が極度の環境変化を生き延びるために重要であるようであるが、それは哺乳動物においてはまだ立証されていない。
EXAMPLE 1
[00171] All organisms possess a primitive survival instinct. When plants are subjected to significant external stresses they activate a mechanism to survive that causes dedifferentiation of cells and enables regeneration of the injured area or the entire organism. While such mechanisms appear to be essential for lower organisms to survive extreme environmental changes, they have yet to be documented in mammals.
1ｂ）明細書段落【０１４８】
「本発明者らは、物理的ストレスが、成熟哺乳動物細胞を、植物および下等生物において見られるものに類似した、幹細胞状態に復帰させ得ると仮定した。この仮説を検討するために、７つの成体体細胞組織から入手した熟細胞を研究した。まず、どの物理的ストレ スが成熟細胞を変化させてより成熟でない状態に復帰させることに最も有効であり得るかに焦点を合わせるために、Ｏｃｔ４－ＧＦＰマウスから回収したＣＤ４５陽性リンパ球を研究した。このマウス由来の細胞は、幹細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターが活性化される と幹細胞表現型への復帰の読み出し情報（readout）を提供する。成熟し、完全に分化した細胞をいくつかの重大な外部刺激に曝露した。
[00172] The inventors hypothesized that physical stress may cause mature mammalian cells to revert to a stem cell state, similar to that seen in plants and lower organisms. To examine this hypothesis, mature cells procured from seven adult somatic tissues were studied. To first focus on which physical stresses might be most effective in altering mature cells to revert to a less mature state, CD45 positive lymphocytes harvested from Oct4-GFP mice were studied. Cells from these mice provide a readout of reversion to a stem cell phenotype when the stem cell specific Oct4 promoter is activated. The mature, fully differentiated cells were exposed to several significant external stimuli.
＞＞請求項１に記載の「細胞」に植物および下等生物の細胞が含まれるとすると、新規性がない。
したがって、請求項１に記載の「細胞」には、植物および下等生物の細胞は含まれないと解釈される。
哺乳類以外の脊椎動物では、どうだろうか？
1c）明細書段落【０１５２】
諸言
全ての生物はそれ自体を環境に適応させそしてその身体を再生することによってストレ ス性刺激に関連する損傷を生き延びるための共通の本能を有しているようである。植物において、個体発生は、接合子だけでなく完全に分化した細胞および未成熟の花粉において も観察される。脊椎動物において、イモリはその肢を含むいくつかの解剖学的構造および 器官を再生する能力を有する１。植物およびイモリの両方によって示される驚くべき再生 能力が外部刺激によって誘導され、これが以前には完全に分化していた体細胞の細胞性脱分化を引き起こすことに特に留意される。生命の最も初期の形態から何十億年も経過し、 そして様々な生物が特有の方法で進化してきたが、この生存本能は現代の生物の共通の祖先から受け継がれているかもしれない。最終分化した哺乳動物細胞は分化プロセスを逆転 する能力を有しないと通常考えられているが、哺乳動物は強烈な環境変化に応答して死を 回避するための以前には認識されていなかったプログラムを保持しているかもしれない。
[00177] All organisms appear to have a common instinct to survive injury related to stressful stimuli by adapting themselves to the environment and regenerating their bodies. In plants, ontogenesis is observed not only in zygotes but also in fully differentiated cells and immature pollen. In vertebrates, newts are capable of regenerating several anatomical structures and organs, including their limbs1. Of particular note is that the remarkable regenerative capacity demonstrated by both plants and newts is induced by external stimuli, which cause cellular dedifferentiation of previously fully differentiated somatic cells. While billions of years have passed from the earliest form of life, and different organisms have evolved in unique ways, this survival instinct may be inherited from a common ancestor to modern-era organisms. Although terminally differentiated mammalian cells are normally believed to be incapable of reversing the differentiation process, mammals may retain a previously unappreciated program to escape death in response to drastic environmental changes.
＞＞イモリの黒焼きを知る人であれば、その再生能力は有史以前から公知であると思うに違いない。
＞＞起案日平成２９年 ２月２３日付け拒絶理由通知書で担当審査官は、
・引用文献１（国際公開第２０１１／００７９００号）において、低酸素条件や低栄養条件等の細胞ストレスへの暴露と、生き残った細胞を回収することを含む多能性幹細胞又は多能性画分を生成・単離する方法が記載され、
得られた細胞はNanog等の多能性マーカーを発現する点（第41頁第3段落）、同細胞等を薬剤スクリーニングに用い得る点（第29頁最終段落）、同細胞等を再生医療等の治療用途に用い得る点（第30頁第1,2段落）について開示されている。
・引用文献２（国際公開第２００９／０５７８３１）には、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、Octファミリー遺伝子等を体細胞に導入する工程を含む方法が記載され、得られた細胞は各種多能性マーカーを発現する点、ES細胞と同様にゼラチンコードした組織培養プレートには接着しなかった点（[0078]）、同細胞等を薬剤スクリーニングに用い得る点（[0056]-[0059]）、同細胞等を治療用途に用い得る点（[0058]）について開示されている。
と指摘している。
＞＞平成２９年９月７日付け手続補正書で出願人は、
【請求項１】 細胞を、低ｐＨストレスに供する工程を含む、Ｏｃｔ４を発現する細胞を含有する細胞塊を生成する方法であって、該低ｐＨが、５．４～５．８のｐＨであり、且つ、ｐＨの調整がＡＴＰを用いて行われることを特徴とする、方法。
と補正した。多能性細胞（pluripotent cell）はどこに行ってしまったのか・・・。
(発明の名称は、依然として、多能性細胞のデノボ生成である。 )
＞＞平成２９年９月７日付け意見書で出願人は、
「引用文献１及び２は、当該発明特定事項を何ら開示も示唆もしておりません。 審査官殿は、「細胞ストレスの種類、ストレス曝露期間、用いる細胞種等は、当業者が適宜設定すべき事項である」と指摘されていますが、無数にある細胞ストレスの中から、「Ｏｃｔ４を発現する細胞を含有する細胞塊」を得る目的で、特定ｐＨ範囲の低ｐＨストレスを選択し、しかもＡＴＰによりｐＨを調整することに、当業者が容易に想到し得たとは到底考えられません。 」
と反論している。
＞＞また、同意見書で出願人は、実施可能要件およびサポート要件について、
「このストレス条件（即ち、ＡＴＰにより調整された５．４～５．８の低ｐＨ ストレス）については、本願の発明の詳細な説明において、Ｏｃｔ４遺伝子を発現する細 胞を含有する細胞塊を生成したことが具体的に示されています（本明細書の段落［０１５５］～［０１６４］、［０１９０］～［０１９６］等をご参照ください）。従いまして、 本願の発明の詳細な説明は、新請求項１に係る発明を、当業者が実施可能であるといえる程度に明確且つ十分に記載しており、また、新請求項１に係る発明は、発明の詳細な説明に記載されたものです。 」
と主張している。
＞＞また、同意見書で出願人は、発明の信憑性、再現可能性に関し、
「参考文献の１つとして審査官殿より引用された「１１.Hitoshi Niwa, et al.，Scienti fic Report，２０１６年６月，6:28003，p.1-9，doi: 10.1038/srep28003」には、新請求項１に係る発明が、当業者により再現できた事実が明確に示されています（当該文献のｐ ２、下から８行目～２行目；ｐ３、上から１６行目～２３行目及び上から２７行目～３１ 行目；ｐ５、上から１行目～４行目及び下から８行目～５行目、図１等をご参照ください ）。具体的には、当該参考文献中のこれらの箇所においては、ＡＴＰを用いての低ｐＨストレスを細胞に与えることによって、細胞塊が生成し、且つ当該細胞塊にはＯｃｔ４遺伝 子が発現している細胞が含まれていたことが端的に記載されています。従いまして、新請求項１に係る発明は、本願明細書の実施例においてだけでなく、当該技術分野において一流誌の１つと認められている学術雑誌に掲載された論文によっても実施可能であることが 実証された発明にほかなりません。 」
と主張している。
＞＞理化学研究所の副チームリーダー 丹羽仁史 氏は、2014 年 12 月 19 日付けで
ＳＴＡＰ現象の検証結果（http://www3.riken.jp/stap/j/r2document1.pdf）において、
「STAP 現象の確認に至らなかったこと」を報告している。
＞＞平成３０年 ２月 ８日（起案日）の拒絶査定において担当審査官は、
備考欄「＜特許法第３６条第６項第１号（サポート要件）について＞」で
「ここで、細胞の分化・脱分化誘導においては、Ｏｃｔ４遺伝子は多能性マーカーの１つではあるものの、当該遺伝子の発現のみをもって多能性細胞が生成したということができないことが本願出願時の技術常識である。さらに、その発現レベルについても、例えば、ＥＳ細胞等と比較して生物学的に意義のあるレベルで発現することが請求項に規定されているわけでもなく、その発現レベルにかかわらず単にＯｃｔ４を発現するという性質を有する細胞を含有する細胞塊を生成したというだけでは、細胞を脱分化させて多能性細胞を生成したこと、すなわち、本願発明の課題を解決したことにならないことは、出願時の技術常識に照らし、明らかである。そうすると、発明の詳細な説明には、Ｏｃｔ４を発現する細胞を含有する細胞塊であれば、本願の上記課題を解決できると当業者に認識できる程度に記載されているとはいえない。 」としている。
