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MONOZUKI’s blog

STAP細胞にかかわる特許請求の範囲を読む

【請求項14】 ~【請求項16】

【請求項14】  ストレスが約3.0~約6.8のpHに細胞を曝露することを含む、請求項1~13のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-13, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 3.0 to about 6.8.

【請求項15】  ストレスが約4.5~約6.0のpHに細胞を曝露することを含む、請求項1~4のいずれか1項記載の方法。

 The method of any of claims 1-4, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 4.5 to about 6.0.

【請求項16】  ストレスが約5.4~約5.8のpHに細胞を曝露することを含む、請求項15記載の 方法。

  The method of claim 15, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 5.4 to about 5.8.

 

>>pH5.4~5.6の酸溶液が最も効率的に細胞を変化させるとの記載はあるが、図5Bにおいて上下限値を特定するための閾値に関する記載はない。

 

14a)明細書段落【0155】

 結果

 成熟体細胞に適用された重大な物理的および化学的刺激。胚性転写因子Oct4は細胞 の多能性状態の調節に決定的であると考えられているので、最初のストラテジーは、どの 外部刺激が最も効率的に成熟細胞を変化させて、Oct4を発現するようにリプログラム されるようにするかを同定することであった。未分化細胞の混入を回避するために、まず 、CD45陽性造血系列細胞を研究した。Oct4-GFP(GOF)マウス8から入手 した脾臓から回収したCD45陽性細胞を、種々の重大な物理的および化学的刺激に曝露 した。曝露は以下を含んだ:浸透圧処理、重大な機械的トリチュレーションでの処理、低 pHへの曝露、ストレプトリシンO(SLO)を使用する細胞膜損傷の適用、低栄養への 曝露、ならびに低酸素および高Ca2+濃度への曝露。次に、GFP発現細胞を、FAC Sを使用して同定し、分別し、そして回収した。Oct4の遺伝子発現をRT-PCRに よって確認した。適用した刺激の各々への曝露によって、ある程度成熟細胞がGFPを発 現するようにリプログラミングされた(図5A)。低pHの化学的ストレスおよび重大な 機械的トリチュレーションの物理的ストレスへの成熟細胞の曝露が、成熟細胞をOct4 を発現するように変化させることに最も有効な処理であるようであった。Oct4発現細 胞への転換を誘導するための至適pHを決定するために、CD45陽性細胞を、変動する 酸性(pH4.0~pH6.8)の溶液に曝露した。酸性溶液への曝露の3日後に、細胞 のGFP発現をFACSを使用して分析した。pH5.4~5.6の酸溶液がGFPを発 現するように最も効率的に細胞を変化させた(図5B)。その結果、残りの研究のために 選択するストレス処理として低pHへの曝露に焦点を合わせた。

 

[00180] Results

[00181] Significant physical and chemical stimuli applied to mature somatic cells.

Since the embryonic transcription factor Oct4 is thought to be crucial in regulation of the pluripotent status of cells, the initial strategy was to identify which external stimuli most efficiently altered mature cells to become reprogrammed to express Oct4. CD45 positive hematopoietic lineage cells were first studied in order to avoid contamination with

undifferentiated cells. CD45 positive cells harvested from spleens procured from Oct4-GFP(GOF) mice8 , were exposed to various significant physical and chemical stimuli. The exposures included: osmotic pressure treatment, treatment with significant mechanical trituration, exposure to low pH, application of cell membrane damage using streptolysin O(SLO), exposure to under nutrition and exposure to hypoxia and high Ca2+ concentration. Next, GFP expressing cells were identified, sorted and collected using FACS. Gene expression of Oct4 was confirmed by R-T PCR. Exposure to each of the applied stimuli resulted in reprogramming of the mature cells to express GFP to some degree (Figure 5A). Exposure of the mature cells to the chemical stress of low pH and the physical stress of significant mechanical trituration appeared to be the most effective treatments in altering mature cells to express Oct4. To determine the optimal pH for inducing conversion to Oct4 expressing cells, CD45 positive cells were exposed to solutions of varying acidity, from pH 4.0 to pH 6.8. At 3 days after exposure to an acidic solution, GFP expression of cells was analyzed using FACS. An acid solution with a pH 5.4-5.6 most efficiently altered cells to express GFP (Figure 5B). Consequently, exposure to low pH was focused upon as the stress treatment of choice for the remainder of the study.