【請求項１４】 ～【請求項１６】
【請求項１４】 ストレスが約３．０～約６．８のｐＨに細胞を曝露することを含む、請求項１～１３のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 1-13, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 3.0 to about 6.8.
【請求項１５】 ストレスが約４．５～約６．０のｐＨに細胞を曝露することを含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
The method of any of claims 1-4, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 4.5 to about 6.0.
【請求項１６】 ストレスが約５．４～約５．８のｐＨに細胞を曝露することを含む、請求項１５記載の 方法。
The method of claim 15, wherein the stress comprises exposing the cell to a pH of from about 5.4 to about 5.8.
＞＞ｐＨ５．４～５．６の酸溶液が最も効率的に細胞を変化させるとの記載はあるが、図５Ｂにおいて上下限値を特定するための閾値に関する記載はない。
＞＞平成２９年９月７日付け手続補正書で削除された。補正後の請求項１には、「５．４～５．８のｐＨ」と記載されている。
１４a）明細書段落【０１５５】
結果
成熟体細胞に適用された重大な物理的および化学的刺激。胚性転写因子Ｏｃｔ4は細胞 の多能性状態の調節に決定的であると考えられているので、最初のストラテジーは、どの 外部刺激が最も効率的に成熟細胞を変化させて、Ｏｃｔ４を発現するようにリプログラム されるようにするかを同定することであった。未分化細胞の混入を回避するために、まず 、ＣＤ４５陽性造血系列細胞を研究した。Ｏｃｔ４－ＧＦＰ（ＧＯＦ）マウス８から入手 した脾臓から回収したＣＤ４５陽性細胞を、種々の重大な物理的および化学的刺激に曝露 した。曝露は以下を含んだ：浸透圧処理、重大な機械的トリチュレーションでの処理、低 ｐＨへの曝露、ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）を使用する細胞膜損傷の適用、低栄養への 曝露、ならびに低酸素および高Ｃａ２＋濃度への曝露。次に、ＧＦＰ発現細胞を、ＦＡＣ Ｓを使用して同定し、分別し、そして回収した。Ｏｃｔ４の遺伝子発現をＲＴ－ＰＣＲに よって確認した。適用した刺激の各々への曝露によって、ある程度成熟細胞がＧＦＰを発 現するようにリプログラミングされた（図５Ａ）。低ｐＨの化学的ストレスおよび重大な 機械的トリチュレーションの物理的ストレスへの成熟細胞の曝露が、成熟細胞をＯｃｔ４ を発現するように変化させることに最も有効な処理であるようであった。Ｏｃｔ４発現細 胞への転換を誘導するための至適ｐＨを決定するために、ＣＤ４５陽性細胞を、変動する 酸性（ｐＨ４．０～ｐＨ６．８）の溶液に曝露した。酸性溶液への曝露の３日後に、細胞 のＧＦＰ発現をＦＡＣＳを使用して分析した。ｐＨ５．４～５．６の酸溶液がＧＦＰを発 現するように最も効率的に細胞を変化させた（図５Ｂ）。その結果、残りの研究のために 選択するストレス処理として低ｐＨへの曝露に焦点を合わせた。
[00180] Results
[00181] Significant physical and chemical stimuli applied to mature somatic cells.
Since the embryonic transcription factor Oct4 is thought to be crucial in regulation of the pluripotent status of cells, the initial strategy was to identify which external stimuli most efficiently altered mature cells to become reprogrammed to express Oct4. CD45 positive hematopoietic lineage cells were first studied in order to avoid contamination with
undifferentiated cells. CD45 positive cells harvested from spleens procured from Oct4-GFP(GOF) mice8 , were exposed to various significant physical and chemical stimuli. The exposures included: osmotic pressure treatment, treatment with significant mechanical trituration, exposure to low pH, application of cell membrane damage using streptolysin O(SLO), exposure to under nutrition and exposure to hypoxia and high Ca2+ concentration. Next, GFP expressing cells were identified, sorted and collected using FACS. Gene expression of Oct4 was confirmed by R-T PCR. Exposure to each of the applied stimuli resulted in reprogramming of the mature cells to express GFP to some degree (Figure 5A). Exposure of the mature cells to the chemical stress of low pH and the physical stress of significant mechanical trituration appeared to be the most effective treatments in altering mature cells to express Oct4. To determine the optimal pH for inducing conversion to Oct4 expressing cells, CD45 positive cells were exposed to solutions of varying acidity, from pH 4.0 to pH 6.8. At 3 days after exposure to an acidic solution, GFP expression of cells was analyzed using FACS. An acid solution with a pH 5.4-5.6 most efficiently altered cells to express GFP (Figure 5B). Consequently, exposure to low pH was focused upon as the stress treatment of choice for the remainder of the study.
